Preimplantační genetická diagnostika – současný stav

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) se rozvíjí od 90. let 20. století. Je prováděna ve specializovaných centrech pro léčbu neplodnosti. Má, když pomineme okrajové indikace, dvojí smysl. Na jedné straně je velmi efektivním nástrojem prevence vzniku vrozených vývojových vad u dětí rodičů, kteří jsou nositeli genetické vady, na druhé straně podstatně zvyšuje šanci na porod dítěte u partnerů s reprodukčními problémy. V obou indikacích je celosvětově PGD stále více používána, nejvíce léčebných cyklů je prováděno v USA. Evropská a některá mimoevropská PGD centra jsou sdružena ve společnosti pro preimplantační genetickou diagnostiku při Evropské společnosti pro lidskou reprodukci a embryologii (PGD Consortium ESHRE). Česká republika má v konsorciu jedno centrum, zařazené mezi velká PGD centra. Konsorcium sbírá a hodnotí výsledky z jednotlivých center a vydává doporučení ke správné klinické a laboratorní praxi při provádění PGD.

Do zavedení PGD byla jedinou možností vyloučení genetické vady před narozením tak zvaná prenatální genetická diagnostika. Ta spočívá v tom, že u již probíhajícího těhotenství je zjišťována (pomocí ultrazvuku, biochemického vyšetření mateřské krve, vyšetření vzorku plodové vody nebo vzorku choriových klků z placenty) vrozená vada a pokud je zjištěna, těhotenství je ukončeno umělým potratem. Žena se často mnohokrát pokouší otěhotnět a dochází ke sponánnímu potratu, nebo je opakovaně je zjišťován vznik vady a je proveden potrat umělý. To má neblahý vliv na fyzický i psychický stav ženy.

PGD pro vyloučení genetické vady 

PGD je schopna vyloučit embrya nesoucí genetickou vadu v podobném spektru, jako prenatální genetická diagnostika prováděná z plodové vody nebo choriových klků. Umožňuje diagnostikovat u časných embryí odchylky v počtu chromozomů (aneuploidie), nebo v jejich struktuře (translokace reciproční a Robertsonské, delece) i genové mutace. Pro diagnostiku početních a strukturních anomálií používáme většinou metody cytogenetické, pro různé druhy genových mutací potom metody molekulární genetiky.

Nejčastěji používanou cytogenetickou metodou je FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), kdy jsou chromozomy nebo jejich úseky ve zkoumaném vzorku znázorněny tak, že se na ně váže specifická sonda označená fluorescenčním barvivem a z obrázku získaného ve fluorescenčním mikroskopu je zjištěno, zda počet chromozomů je normální, případně který chromozom chybí nebo přebývá. Lze také zjistit, zda struktura určitého chromozomu je normální, nebo některý jeho úsek chybí nebo přebývá, což všechno by mohlo vést ke vzniku vrozené vady.

Molekulárně genetické metody jsou založeny na zmnožení (amplifikací) DNA vzorku pomocí PCR (Polymerase Chain Reaction) ve speciálním přístroji (thermocycler). Zmnoženou DNA je možno analýzovat a zjistit například mutace genů, které by způsobovaly tzv. monogenní choroby, jako je hemofilie, cystická fibróza a mnoho dalších.

Spektrum používaných metod se neustále rozšiřuje, v začátcích je využití srovnávací genové hybridizace (Comparative Genomic Hybridization, CGH), kvantitativní PCR a dalších metod. Tyto metody umožní vyšetřit genetickou výbavu embrya ještě daleko komplexněji než dosud.

Provedení cytogenetických i molekulárně genetických vyšetření v rámci PGD je velmi náročné pro nepatrné množství výchozího materiálu (1-2 buňky), proto je nutno provádět je za zvláštních podmínek a postupy pečlivě vypracovat a natrénovat.

PGD u reprodukčních problémů 

Embrya nesoucí chromozómové vady většinou ukončí spontánně svůj vývoj ještě před implantací nebo se potratí v prvním trimestru gravidity. Například u translokací končí až 90% zjištěných těhotenství (bez preimplantačních ztrát) spontánním potratem. Postižené páry potom vnímají svůj problém převážně ne jako riziko vzniku vrozené vady, ale jako neschopnost otěhotnět. I u zdravých žen se pohybuje zastoupení aneuploidních oocytů od 17% u žen na začátku reprodukčního věku po 74% před začátkem klimakteria. To znamená, že reprodukční schopnost žen klesá z genetických příčin s věkem. Proto představuje PGD významný přínos pro léčbu poruch plodnosti, zejména v současné době, kdy se mateřství posouvá do vyšších věkových skupin. I při léčbě jiných typů neplodnosti může použití PGD jako screeningové metody pro vyloučení aneuploidií podstatně zlepšit výsledek. U reprodukčních problémů používáme při vyšetření cytogenetických metod, shodných jako u PGD pro vyloučení genetické vady.

Jak se preimplantační genetická diagnostika provádí 

Preimplantační genetickou diagnostiku je možno provést buďto z pólových tělísek oocytu, nebo z buněk vyvíjejícího se embrya. Diagnostika z pólových tělísek má řadu limitací a je indikována pouze ve velmi specifických případech nebo v zemích, kde PGD u embryí nelze z legislativních důvodů použít. V naprosté převaze případů je celosvětově PGD prováděna z buněk embryí, z toho opět převážně třetí den po oplození.

Předpokladem provedení PGD z buněk embryí je oplození oocytů (vajíček) pacientky in vitro (většinou metodou intracytoplazmatické injekce spermie, kdy jedna spermie je zavedena mikromanipulátorem přímo do vajíčka). Embrya se vyvíjejí in vitro do 3. dne (den oplození je dnem 0), kdy embryo je, pokud je jeho vývoj optimální, na 8-buněčném stadiu. Z tohoto embrya se odeberou pomocí mikromanipulace jedna nebo dvě buňky (blastomery). Tato ztráta části buněk neovlivní další vývoj embrya, buňky jsou ještě totipotentní. Buňky jsou vyšetřeny, jak bylo popsáno výše. Embrya se mezitím vyvíjejí do 5. dne, kdy v optimálním případě dosáhnou stadia blastocysty. Před transferem embrya je proveden výběr podle výsledku genetického vyšetření a podle morfologie a dosaženého stupně vývoje. Jedno až dvě embrya jsou potom přenesena do děložní dutiny, kde proběhne v následujících hodinách a dnech implantace embrya do děložní sliznice jako při přirozeném oplození.

Preimplantační versus prenatální genetická diagnostika 

Zdá se, že ve srovnání s prenatální diagnostikou je v případech, kdy potenciální rodiče vědí o svém genetickém handicapu, preimplantační genetická diagnostika bezkonkurenční. Pro ženu je daleko přijatelnější absolvovat jeden nebo několik cyklů asistované reprodukce s PGD než se pokoušet mnohokrát otěhotnět a buďto spontánně potrácet nebo podstupovat opakovaně prenatální diagnostiku následovanou přerušením těhotenství. Nehledě k psychické a zdravotní zátěži je ve hře i časový faktor, snaha o spontánní otěhotnění se v těchto případech může protáhnout na dlouhá léta.

Jaké jsou výsledky PGD 

V současnosti už se pohybují počty dětí narozených po aplikaci PGD celosvětově v tisících, v České republice se dosud narodilo kolem 30 dětí, což není zatím velký počet například ve srovnání s počtem dětí narozených po „klasických“ metodách asistované reprodukce, kterých jsou v naší republice každoročně tisíce (více než 3% z počtu narozených dětí). Pokud jde o kvalitativní úroveň u nás, bylo dosaženo těhotenství po diagnostice translokací, neurofibromatózy I (evropská priorita) a dalších. Pravděpodobnost otěhotnění v 1 cyklu je v současnosti asi 30% a nepochybně poroste. Čeští kliničtí genetikové jsou zatím málo informováni o možnostech metody a pacientům ji nabízejí jen vyjímečně. Bylo by prospěšné, metodu více využívat například u heterozygotních párů – nositelů cystické fibrózy, hemofilie a dalších.